Modh Taighde Mhóilíneach géiniteach

Iniúchadh a dhéanamh ar agus leaganacha a aithint i struchtúr DNA a úsáidtear modh ghéiniteach mhóilíneach. I gcás gach réigiún DNA, a iniúchann réigiún seo den crómasóim, géine nó ailléil, tá difríochtaí na modhanna a roghnú. Bhunúsach gach modh ghéiniteach mhóilíneach Cuimsíonn roinnt nó ionramháil eile RNA agus DNA. Gach na modhanna tréithrithe ag chastacht ollmhór, gan nach féidir choinníollacha saotharlainne a chur i gcrích, agus ní mór don fhoireann a bheith ardcháilithe. Tá an obair a rinneadh i gcéimeanna éagsúla.

céimeanna

Gcéad dul síos, RNA nó DNA samplaí a thabhairt ar aird. Anseo, is féidir le modh ghéiniteach mhóilíneach chur i bhfeidhm ar aon ábhar beagnach: braon fola, leukocytes, fibroblasts cultúr, mhúcóis (scríobtar), fiú na follicles gruaige, - DNA a fháil ó aon sampla. Tá sé oiriúnach a úsáid ar aon mhodhanna ghéiniteach mhóilíneach agus a gcuid roghanna éagsúla agus tá Tá DNA scoite le fada stóráil reoite. Is é an dara céim atá tiomnaithe do an carnadh na blúirí atá ag teastáil (aimpliú) den DNA, mar go gcuidíonn sé a chinntiú imoibriú slabhrúil polaiméaráise in vitro (in vitro gan aon bhaint ag orgánach beo). Mar thoradh air sin, na multiplies blúire DNA arna roghnú ag an imoibriú slabhrúil, agus an méid na méaduithe DNA literally milliúin na n-amanna.

Is é an tríú céim sna modhanna taighde géiniteach móilíneacha Glactar srian iolrú DNA (an ilroinnt, tearing nó a ghearradh). Srian le comhlíonadh ag leictreafóiréis ar polyacrylamide nó glóthach agarose. Ceadaíonn an modh móilíneach-géiniteach déanamh staidéir ar an blúire DNA gach duine a ghlacadh ar shuíomh áirithe san fhoirmiú. Ina dhiaidh sin, tá an t-fhoirmiú cóireáilte le bróimíd ethidium, atá in ann ina gceangal leis DNA, an ionradaíochta le solas ultraivialait, ansin is féidir a thabhairt faoi deara codanna luminescence. Tá modhanna diagnóiseacha géiniteach Mhóilíneach éagsúil agus go leor, ach tá an chéad dá chéim is coiteann do gach. Ach d'fhonn a blúirí DNA a aithint, is féidir leis an ghlóthach a bheith daite, agus go leor modhanna eile atá ann cheana.

speicis

Is féidir an modh thuasluaite mhóilíneach foghlama DNA géiniteach Ar na modhanna is dírí agus forleathan do Mycobacteria bhrath. Is é a bunúsach sin, d'fhonn an t-ábhar slabhra scanadh ar blúirí sonracha DNA na pataiginí a aithint. Ni dhéanann na teicnící Mhóilíneach diagnóiseacha géiniteach fós ar bhealach níos éifeachtaí a aithint galair ar nós eitinn. Ag baint úsáide as an imoibriú slabhrúil polaiméaráise (PCR), is féidir leat a bheith cinnte go mbeidh an t-DNA bunaidh cur le líon na cóipeanna i milliún uair, is é sin, beidh aimpliú, agus beidh sé a thaispeáint ar na torthaí. Is é an leibhéal an-ard íogaireachta - níos mó ná nócha cúig faoin gcéad, a bhfuil an buntáiste is mó an modh seo.

An chuid eile de na modhanna mhóilíneach-géiniteach thaighde ar éifeachtacht na iliomad cóipeanna teacht isteach faoi dhó go litriúil, ós rud é léiríonn sa chás seo an sampla a dhréachtú seicheamh oligonucleotide ar leith a mhéadú go dtí 106 uair. Fiú an diagnóis cultúr eitinn an chórais riospráide níos ísle go mór a bheith íogair. Sin é an fáth go bhfuil leigheas nua-aimseartha atá bunaithe ar mhodhanna ghéiniteach mhóilíneach de diagnóis eitinn. Tá modh cur síos éifeachtach, go háirithe agus iad ag déileáil le pataiginí de inathraitheacht antaigineach ard, a chinneadh ar an mbealach eile i bhfad níos deacra - Éilíonn speisialta meáin cothaitheach agus cultivating feadh i bhfad. tháirgeadh modhanna géiniteacha bithcheimiceach agus móilíneacha éifeacht an-difriúil ar na torthaí.

diagnóis eitinn

Marshall PCR diagnóis eitinn is coitianta ag baint úsáide as carachtair sin DNA bhaineann go sonrach le haghaidh na ceithre chineál an galar. Chun seo a bhaint amach an sprioc úsáid go minic primers a bhrath IS ord eilimintí (IS-986, IS-6110), mar a characterize na gnéithe speicis mhórimirceacha eitinn Mycobacterium agus i gcónaí ilchóipeanna i láthair sa genome. Freisin, is féidir eastóscadh DNA a chur i gcrích ó chultúir íon agus Cliniciúil (sputum na n-othar) ar aon mhodh oiriúnach eile. Mar shampla, an modh Boom ann ina bhfuil an maolán lysis úsáidtear bunaithe ar an thiocyanate guanidine agus shilice mar an DNA iompróir. Líon na n-othar atá difriúil baictéareolaíochta bocht ag méadú gach bliain, agus dá bhrí sin tá i gcleachtas cliniciúil atá bunaithe ar leibhéal go hiomlán difriúil na heagraíochta: Tá Modh móilíneach-géiniteach ag déanamh staidéir ar DNA ag imirt ról mór i an diagnóis.

Mar sin féin, ní mór dúinn a admháil go léir nach bhfuil sé gan míbhuntáistí. Is é an modh PCR Tugann an úsáid a bhaint minic líon mór de torthaí bréagach-dearfach, agus is é an chúis ní hamháin earráidí teicniúla, ach freisin ar na gnéithe de na modh féin. Lena chois sin, ag baint úsáide as an modh seo de diagnóis a chinneadh an inmharthanacht Mycobacteria, atá aitheanta, tá sé dodhéanta go simplí. Ach nach bhfuil sé seo faoi mhíbhuntáiste an ceann is tábhachtaí. gceist modhanna géiniteacha Mhóilíneach diagnóisic PCR bhaol éillithe an DNA mycobacterial. riachtanais deimhniúcháin ar an gcúis go do shaotharlanna PCR deartha go heisiach crua, éilíonn siad trí áitreabh ar leith. Is PCR teicneolaíocht nua-aimseartha agus an-chasta, éilíonn sé úsáid a bhaint as trealamh cuí agus pearsanra ard-oilte.

bacterioscopy

Nuair Ní mór torthaí diagnóis na hanailíse a chur i gcomparáid le sonraí eile: scrúdú cliniciúil, radagrafaíochta, micreascópacht smearaidh, barr agus fiú fhreagairt go mbeidh cóireáil shonrach atá an-tábhachtach. Sa tsraith seo, tá an staidéar PCR ach ceann amháin de na comhpháirteanna. Braith an pataigin sa diagnóis luath a bheith ar na modhanna simplí agus is tapúla - baictéareolaíochta.

Tá a úsáidtear micreascóp solais (dathú Ziehl-Neelsen) agus fluaraiseacha (fluorochromes dathúcháin). Is é an buntáiste luas smearaidh na torthaí. Ach tá a míbhuntáiste mheas ceart an cumas teoranta mar gheall ar íogaireacht íseal. Mar sin féin, tá an modh atá tugtha WHO mholadh mar an chuid is mó eacnamaíoch agus an talamh a bhrath d'othair eitinn. Tá bhrath modh Mycobacteria baictéareolaíoch luach thuar agus measta eisfhearadh cainníochtúil baictéarach. I bhfad níos mó muiníne chun déileáil leis móilíneach modhanna taighde géiniteach ar eitinn.

Cultúir

bhrath níos fearr Mycobacteria aithníonn staidéar cultúrtha. Cur ábhar paiteolaíocha go bhfuil sé déanta isteach sa mheán ubh: Mordovsky, Finn II, LJ, agus a leithéidí. Tagarmharcanna friotaíochta a Mycobacteria do chógais agus fianaise indíreach ar éifeachtacht roinnt Mycobacteria agus a gcoilíneachtaí in vitro, más rud é an modh ar baineadh de chultúr taighde. Chun cur leis an céatadán de iargúltacht na ionaclaithe Mycobacteria d'ábhar paiteolaíocha ar siúl ar thimpeallachtaí éagsúla.

Freastal ar riachtanais chultúrtha, deontais agus sreabháin iomadúla pataigin lena n-áirítear. A úsáidtear sa chóras seo agus cineál méadrú uathoibrithe VANTES fás. Ní mór Barraí bheith ar siúl i goir feadh suas le seacht ocht seachtaine. Faoin am seo is féidir leis an barr leis an easpa fáis a chur san áireamh diúltach. Is é an bealach is éifeachtaí a bhrath eitinn Mycobacterium mheas samplaí bitheolaíocha: diagnóiseacha muca guine ábhar Infect, atá thar a bheith a oirfeadh do TB.

roinnt figiúirí

réimse suimiúil staidéir, a d'oscail diagnóisic PCR bhí chun staidéar a dhéanamh ar an eitinn M. - ionfhabhtú folaigh. Tugann an coincheap nua-aimseartha an ionfhabhtaithe TB gur as céad daoine a bhí i dteagmháil le M. eitinn, nócha a ionfhabhtaithe go maith, ach amháin deich acu Tá galar gníomhach á fhorbairt. Daoine eile díolúine Eitinn, agus mar gheall ar nócha faoin gcéad de na cásanna fós an t-ionfhabhtú folaigh. Braith patrún chuidigh sé ina modh ghéiniteach mhóilíneach.

Geneticists rá go bhfuil caoga a cúig faoin gcéad de siúd a bhfuil a barra paiteolaíocha ábhar a bhí diúltach, agus ochtó faoin gcéad de na daoine ionfhabhtaithe le M. eitinn, ach ag sileadh gan aon manifestations radagrafaíochta de ghalar, PCR freagraí dearfacha a fuarthas. Is modh diagnóiseach géiniteach chabhraigh chun othair i mbaol trí staidéir PCR, agus cuirtear torthaí na n-anailísí (micreascópacht agus cultúr) bhí diúltach, agus ba ionfhabhtú subclinical M. eitinn i láthair.

taighde nua-aimseartha

Cónaidhm na Rúise agus saotharlanna baictéareolaíochta a úsáid modh luathaithe de thiúchan iomlán: Gníomhaíocht reductase níotráit de Mycobacteria thástáil Griess imoibrí. ionaid frith-TB úsáid modh a ligeann chun a chinneadh friotaíocht drugaí. Seo síolú i meáin leachtach, i gcás ina uathoibrithe radaiméadracha agus ar an gcóras cuntasaíochta fluaraiseacha fás na Mycobacteria. Déantar anailís den chineál dhéanamh go tapa - suas go dtí dhá sheachtain.

Faoi láthair, tá modhanna nua á bhforbairt: Tá friotaíocht drugaí ar Mycobacteria arna thomhas ag leibhéal géinitíopa. Staidéar ar na meicníochtaí móilíneacha géinte friotaíocht agus léiríonn an láithreacht sa Mycobacteria. Tá na géinte a bhaineann le friotaíocht le drugaí áirithe. Mar shampla, géinte Kasa, Inha, katG resistant a isoniazid, géine rpoB - rifampicin géinte RNA 16Sp agus rpsL - streiptimícin, emb1 - le ethambutol, gyrA - a aghaidh fluaracuineolóin agus mar sin de.

sócháin

An diagnóis nua-aimseartha méadú suntasach ar an modh leibhéal móilíneach-géiniteach chun staidéar DNA agus cead a chur i gcrích staidéir ar scála mór de sócháin ina speictream uile. Anois tá a fhios againn go bhfuil na sócháin is coitianta sa 516, 526 agus 531 codons na géine rpoB, agus d'aithin an friotaíocht le drugaí éagsúla. Tá réimse leathan de mhodhanna chun clóscríobh na Mycobacteria ag baint úsáide as, ní hamháin modhanna traidisiúnta - bithcheimiceach, bitheolaíochta agus cultúrtha, ach freisin a úsáidtear go forleathan teicnící nua-aimseartha ghéiniteach mhóilíneach. Cheana féin tá leordhóthanach agus a chur ar fáil ar an modh diagnóis ceart le haghaidh a bhrath galair monogenic. Tá siad bunaithe ar staidéar DNA i achar beacht géine ar leith. Tá sé seo de ghnáth próiseas casta, Tógann am agus costasach, ach tá na sonraí a chuirtear ar fáil trí anailís ghéiniteach mhóilíneach é, i bhfad níos cruinne agus faisnéiseach ná na sonraí de gach anailísí eile.

Tá sé fada ar eolas nach bhfuil an DNA a athrú i gcomhair thréimhse marthana an orgánaigh go bhfuil sé in aon cealla odnakova cnuasta, agus déanann sé indéanta a chur ar an anailís ar hiomlán gach cealla de chuid an chomhlachta, ag céim ar bith ontogeny. Is féidir leis an géine a ndearnadh damáiste dóibh iad a aimsiú roimh an chuma ar na comharthaí chéad go dtí an galar cliniciúil ar scála iomlán, chomh maith le i ndaoine heitrisigeacha sláintiúla, ach a bhfuil claochlú ar an géine. cheadú modhanna galar oidhreachtúil géiniteach Mhóilíneach diagnóiseacha a nochtadh a (cur chuige díreach, DNA-diagnóisic), chomh maith le anailís a dhéanamh ar an deighilt an galar sa teaghlach le DNA loci marcóir (polymorphisms géiniteach), atá nasctha go dlúth le géine millte (ie, an cur chuige indíreach DNA-diagnóisic). Díreach nó go neamhdhíreach - aon diagnóisic DNA atá bunaithe ar na modhanna a aithint ar chuid atá sainmhínithe go docht ar an DNA daonna.

modhanna díreacha

Tá modhanna díreacha de diagnóis DNA nuair a bhíonn an galar culprit géine hereditary dtugtar, mar ar eolas go maith, agus cineálacha a sócháin. Mar shampla, tá oiriúnach modhanna díreacha i roinnt de na galair. Seo chorea Huntington (síneadh CTG-athchraoltaí), phenylketonuria (R408W), fiobróis chisteach (delF508, sócháin móra) agus a leithéidí. Is é an buntáiste is mó de na modh díreach cruinneas diagnóiseacha lánúinéireacht, agus níl aon ghá a dhéanamh ar anailís DNA ar an gcuid eile den teaghlach. Má tá a mutation géine sa comhfhreagrach le fáil, ceadaíonn sé a cheadú go díreach diagnóis de heredity, a chinneadh géinitíopa don chuid eile den teaghlach burdened.

Tá Buntáiste eile diagnóis dhíreach Meastar iompróir heitrisigeach sócháin droch ó ghaolta agus na tuismitheoirí a fuair bás ón ngalar a aithint. Tá sé seo fíor go háirithe do ghalair autosomal cúlaitheach. Tá míbhuntáistí a bhaineann le modhanna díreacha chomh maith ar fáil. Chun iad a fheidhmiú, ní mór duit fios a bheith agat go díreach localize na géine neamhghnácha, struchtúr exon-intron a speictrim agus a sócháin. Níl gach galair monogenic sa lá atá inniu tar éis an fhaisnéis sin faighte. Ní féidir modhanna díreacha Informativeness a bheith comhlánaithe, toisc nach féidir amháin agus na géine céanna a bhfuil líon mór de mutation paiteolaíocha go n-eascraíonn fhorbairt na galair hereditary.

modhanna indíreacha

modhanna indíreacha i diagnóisic DNA a úsáidtear ar chor ar bith, i gcásanna eile, mura bhfuil an géine a ndearnadh damáiste dóibh aitheanta, ach amháin chromosomally, nó más rud é nach raibh an diagnóis líne thabhairt ar an toradh (a tharlaíonn sé, más rud é an ghéin eagraíocht mhóilíneach chasta nó bheag nó a mhór, má tá a lán sócháin paiteolaíocha). modhanna indíreacha a dhéantar anailís leithscaradh marcóirí polymorphic sa teaghlach allelic. Marcóirí le fáil sa réigiún chromosomal céanna nó lócas atá nasctha go dlúth leis an ngalar agus ionadaíocht a dhéanamh scriosadh nó insertions, substitutions pointe, athuair, agus tá a n-polymorphism mar gheall ar an méid éagsúla de chealla sa bhloc.

Is áisiúla chun diagnóis a mheas mícreasaitilít agus minisatellite polymorphisms indíreacha, a dháileadh go forleathan sa genome daonna. a luach arna shloinneadh in ábhar faisnéise ard, más rud é nach bhfuil damáiste don achar géiniteach idir an marcóir agus an ghéin ró-mhór. Sa chás deiridh sin, tá an t-cruinneas meastachán arna chinneadh don chuid is mó ar an minicíocht na recombination idir an marcóir polymorphic agus damáiste. modhanna diagnóiseacha indíreach ar fáil freisin réamhchéim éigeantach minicíochtaí ailléil an staidéir daonra anailís i measc othair agus iompróirí sócháin, móide an gá atá a chinneadh an dóchúlacht recombination na marcóirí nonequilibrium agus greamaitheacht agus ailléilí mutant.

modhanna eile

Ní féidir le codanna achomair ar RNA nó DNA, chomh maith le géine singil visualized faoi staidéar micreascópacha bheith, mar sin, chun sócháin gá ag diagnóis ghéiniteach mhóilíneach a aithint. Tá "Tionscadal Géineoim Daonna", chomh maith le dul chun cinn eile i Géineolaíocht mhóilíneach leathnú go mór ar an bhféidearthacht an diagnóis galar oidhreachtúil - idir roimh agus iarbhreithe. Is féidir leis na modhanna a chur ar fáil a bhrath go luath agus a dhéanamh Polai thuar agus galair monogenic, a bhfuil a bhíonn ar siúl i ndaoine fásta tús. Ar an drochuair, tá mar gheall ar na cumais theicniúla na staidéir ghéiniteacha mhóilíneach uaireanta níos faide ná na teorainneacha eiticiúla atá leagtha maidir le hoidhreacht, go háirithe nuair a bhíonn an diagnóis i measc ógánach agus óige.

Tá Struchtúracha agus uimhriúla abnormalities chromosomal na cúiseanna is coitianta de ghalar agus ailse, agus go leor anchuma. Ní mór aberrations chromosomal a aithint, rud atá tábhachtach do chomhairleoireacht teaghlaigh - chun measúnú a dhéanamh réamhaisnéis, mar aon le riosca atáirgthe in toircheas amach anseo. Tá anailís crómasóm an "caighdeán óir" de diagnóis géiniteach, ach tá sé teoranta. Níl ach na modhanna anailíse ghéiniteach mhóilíneach a dhéanamh níos mó, toisc go úsáidtear chlónáil teicneolaíocht atá bunaithe lipéid fluaraiseacha in ann a n-íogaireacht ard chun athruithe chromosomal subtle agus nach féidir a bhrath clasaiceach aithint staidéir cytogenetic. Tá na teicnící ag leathnú ár n-acmhainní níos diagnóiseacha, nuair a scrúdaíodh, leanaí faoi mhíchumas forbartha, mhoilliú meabhrach, le go leor galair hereditary eile.

torthaí

Tá sé an-tábhachtach don chine daonna a bhí ar an struchtúr géine agus feidhm an eolais, cineálacha éagsúlacht, an cumas a bhrath galar oidhreachtúil a tharla i dtaca le forbairt na géineolaíochta móilíneacha. a modhanna atá dírithe ar an staidéar a dhéanamh ar an móilín DNA - agus nuair a tá sé gnáth, agus nuair a bheidh sé damáiste dóibh. Síneann ullmhú seichimh d'aigéid deoxyribonucleic de nucleotides (DNA) i gcéimeanna ó shamplaí a fháil go blúirí aonair a aithint. Leithlisiú DNA genomic ó na cealla, srian (tearing), aimpliú (chlónáil), leictreafóiréis na blúirí (scaradh lena lucht leictreach agus meáchan móilíneach de réir fhoirmiú agarose). Aithint na blúirí ar leith suite ar an dromchla de stripe scoite.

Is ansin dul isteach ar an scagairí gníomh speisialta, tríd a théann le gach hybridization blúire le blúirí DNA clónáilte nó tóireadóirí radaighníomhacha sintéiseacha rialú, a bheidh comhionann leis gach sampla tástála. Má athraíonn tú an post nó fad i gcomparáid leis an probe, más rud é blúire nua nó imithe - le fios seo go léir go bhfuil na géine anailís ndearnadh athstruchtúrú san ord nucleotide. Tá ocht teicnící bunúsacha na staidéir ghéiniteacha mhóilíneach: seicheamhú (chinneadh ord DNA), imoibriú slabhrúil polaiméaráise (méadú ar líon na sraitheanna), a ullmhú primers aitheanta genes, chlónáil DNA, a tháirgeadh móilíní athchuingreach díorthaithe próitéiní bharr móilíní athchuingreach, a chruthú sraith iomlán (bailiúchán leabharlann) blúirí fuarthas go trí úsáid a bhaint srian clónáilte.